وكانت الخطوة التالية هي فحص كيفية تفاعل مجمع كريسبر معهم، باستخدام برنامج طي البروتين القائم على الذكاء الاصطناعي AlphaFold. تم تصميم الإصدارات المحدثة للتعامل مع التفاعلات بين البروتينات والأحماض النووية، بالإضافة إلى مجمعات البروتينات المتعددة. لذلك قام الفريق بتغذية نسخ AlphaFold من تسلسل الحمض النووي المستهدف، جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي الموجه، وتسلسل Cas9، وإنزيم يعدل القواعد كيميائيًا ويمكنه الالتصاق بـ Cas9.
لسوء الحظ، اختنق، مما أدى إلى وضع أحد البروتينات في مكان كان من الواضح أنه خاطئ.
وبلا عائق، قام الفريق بتبسيط الأمور وإطعام AlphaFold فقط ببروتين DNA وRNA وCas9، لأن الأخير هو العامل الأساسي الذي يحدد خصوصية تسلسله. لقد نجح هذا الأمر بشكل أفضل بكثير، حيث أنتج بنية تتفق مع تلك التي تم تحديدها من خلال التجارب التي أجريت على الأحماض النووية والبروتينات الفعلية.
ومن خلال مقارنة الهياكل التي أنشأها AlphaFold عند تغذية مواقع مختلفة داخل وخارج الهدف، وجد الباحثون نمطًا عامًا. تسببت العديد من المواقع غير المستهدفة (حوالي الثلثين) في أن يتبنى بروتين Cas9 بنية مختلفة قليلاً. لكن جميعها تقريبًا (أكثر من 95%) غيرت الأحماض الأمينية التي اتصلت بالـ RNA. لذلك من الواضح أن هناك بعض الحالات التي يحتفظ فيها Cas9 ببنيته الطبيعية ولكن الأحماض الأمينية الموجودة بداخله تنثني بطرق تستوعب القواعد الخاطئة للمواقع غير المستهدفة.
ومن الملائم أن AlphaFold تم إعداده بالفعل لتحديد ما يسمى “احتمالية الاتصال”، أي فرصة وجود أي عنصرين، مثل الأحماض الأمينية أو النيوكليوتيدات، على مسافة صغيرة جدًا (ثمانية أنجستروم). يمكن للباحثين أخذ نتائج تحليل احتمالية الاتصال للمواقع داخل وخارج الهدف ومقارنتها، وتحديد بالضبط أي الأحماض الأمينية في Cas9 قد غيرت جهات الاتصال عندما يكون هناك عدم تطابق بين دليل الحمض النووي الريبي (RNA) والحمض النووي (DNA). أطلقوا على إعداد التحليل المحوسب هذا اسم “ContactSeek”.
استهداف أفضل
تميل شركة ContactSeek بمفردها إلى إنتاج قائمة كبيرة من الأحماض الأمينية التي تتغير عند ارتباطها بموقع خارج الهدف. لذلك ركز الباحثون على مناطق بروتين Cas9 حيث تتجمع هذه الأحماض الأمينية، معتبرين ذلك علامة على أن هذه المناطق كانت تتكيف مع الاختلافات الناجمة عن القواعد غير المتطابقة. ثم بدأوا باختبار إصدارات Cas9 بأحماض أمينية مختلفة في هذه المواقع.
